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为分析决上述问题，韩国光州科研技术院 Dongryeol Ryu团队以胶原为基、丝素蛋白为增强相，先将人脂肪干细胞（hASCs）混入制成复合生物墨水；再顺利获得“离心-发泡”制得均一多孔凝胶后，引入“单轴拉伸”工艺，使孔道与胶原纤维同步定向，形成仿生骨骼肌的各向异性微结构。该法无需电场或双重光交联，简便可控。结果表明，所得胶原/丝素-多孔-hASC构建体在力学强度、细胞存活、肌向分化及体内体积性肌肉缺损（VML）修复方面均显著优于传统无序多孔或单纯胶原体系，证明其可作为肌肉及其他各向异性组织再生的通用平台。该文章于2025年7月10日以《Cell-Laden Constructs with Anisotropic Pores Fabricated by Collagen/Silk-Fibroin for Muscle Tissue Regeneration》为题发表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202503933）。

（1）不同胶原基泡沫和复合材料的微观结构和生物效应图解

图1a、b显示了高孔隙度胶原蛋白细胞负载支架的结构特征及其优缺点。该结构具有良好的生物相容性和细胞黏附增殖能力，但纯胶原支架机械强度低，限制其在负重组织构建中的应用。图1c展示了顺利获得引入S–F形成分子间互穿聚合物网络（IPN）以增强胶原支架力学性能的策略。该复合结构在保持孔隙度和生物相容性的同时显著提高了机械性能，适用于软骨、肌腱等对力学性能要求较高的组织工程（图1c）。图1d展示了顺利获得3D打印过程引入拉伸步骤构建具有各向异性孔结构的胶原/S–F支架。该结构模拟天然组织中细胞外基质（ECM）的有序排列，支持细胞定向排列及组织导向形成（图1d）。进一步地，图1d还显示了构建体中整合hASCs后的应用效果。各向异性孔结构结合IPN增强网络为细胞排列及分化给予良好微环境，展现出在肌腱、韧带和心肌等具有方向性力学需求组织再生中的应用潜力（图1d）。

图1 不同胶原基泡沫和复合材料的微观结构和生物效应图解。a) 搅打前的胶原水凝胶，显示均匀的凝胶基质。b) 以 2500 rpm 的转速搅打后的胶原泡沫，其中空气被注入基质，导致形成多孔结构和胶原聚集。c) 胶原蛋白/丝素蛋白 (S-F) 复合泡沫，显示胶原蛋白和 SF 之间形成互穿网络 (IPN)，从而形成增强的、更稳定的多孔结构。d) 使用收集器 (宽度 = 6 mm) 以 75 rpm 的转速形成的拉伸多孔复合泡沫，展示了孔隙的排列以及更明确和结构化的泡沫形态的开展

（2）选择合适的胶原蛋白和S-F混合比例以取得稳定的形态结构

胶原蛋白因其丰富的细胞黏附位点常用于组织再生研究；S–F则具有优异的力学性能，常用于负重组织修复（图2a）。两者在胶凝过程中分别顺利获得胶原纤维化和S–F的β-折叠形成互穿聚合物网络（IPN），显著增强复合材料的力学性能。图2b显示胶原蛋白具有接近1:1的两性特性，而S–F则以疏水性为主（约8:2），图2c示意顺利获得打发过程诱导泡沫结构形成。图2d提出较高胶原含量有利于稳定泡沫的构建，而高S–F比例则削弱泡沫稳定性。

将5 wt.%胶原和5 wt.% S–F按不同比例混合（CS10、CS73、CS55、CS37、CS01），稀释至总浓度约2.8%。光学显微镜与SEM图像显示所有组别均形成泡沫结构，但纯S–F组无胶原纤维形成（图2e）。随着S–F比例增加，孔径增大（图2f）、泡沫体积分数下降（图2g）、Laplace压降低（图2h），说明泡沫稳定性变差。CS73组泡沫生成速度较快（图S2a,b），孔体积分数与孔径与CS10无显著差异，提示其具备良好结构稳定性。

FT-IR分析（图2i）显示S–F经打发后酰胺I带位移（1650→1627 cm^-1），说明发生β-折叠结构形成；酰胺II带位移（1523→1546 cm^-1）提示S–F与胶原相互作用引起二级结构改变。CD谱图（图S3）显示，CS10在222 nm处具有典型三螺旋峰，添加S–F后该峰减弱，表明胶原结构受其影响，促进纤维形成。

综上，S–F疏水性过强会干扰气液界面形成及IPN网络建立，但在胶原与S–F比例为7:3时，可快速形成结构稳定、泡沫性能良好的复合支架，兼具高孔隙度与优良力学性能，适用于对力学强度和结构稳定性要求较高的组织工程应用。

图2 胶原蛋白和S-F之间的互穿聚合物网络（IPN）、它们的分子结构、泡沫形成的搅打过程以及泡沫性能的表征。a）纤维化胶原蛋白和β折叠形成的S-F之间的IPN示意图。b）胶原蛋白和S-F的分子结构和两亲性。c）搅打过程示意图和d）胶原蛋白（左）和S-F为主（右）泡沫中随之形成的气液界面示意图。e）光学和扫描电子显微镜（SEM）图像，f）孔径（n=30），g）注入空气的最大分数（n=3），以及h）计算得出的具有不同胶原蛋白/S-F混合比（CS10、CS73、CS55、CS37和CS01）（n=3）的泡沫的拉普拉斯压力。i）搅打前泡沫和纯S-F的FT-IR分析。所有数据均以平均值±SD表示（NS = 统计无显著性，* p < 0.05，** p < 0.01，和*** p < 0.001，使用带有ANOVA和Tukey的HSD事后检验的SPSS软件进行分析）

（3）搅打复合生物墨水的流变性和印刷适性

图3a显示未打发与打发后的不同胶原/S–F比例生物墨水在水平与倾斜表面上的形貌。未打发前，S–F含量越高，液滴流动性越强（图S4a,b），表明粘度下降；打发后各组差异明显减小。图3b展示IPN结构形成提高生物墨水粘度与结构稳定性的机理。在打印性能测试中，CS10在25G喷嘴下挤出后无法保持条带形状，表现为液滴态（图3c）；CS73表现出较好的条带陆续在性与均一性；CS55次之；CS37挤出困难并堆积于喷嘴口。纤维塌陷测试结果（图3d和图S6）进一步证实，CS10条带在支柱间间距大于3 mm时发生断裂；CS73在6 mm间距下仍可保持完整结构；CS55结构不稳定；CS37无有效连接。剪切速率扫描（图3e，图S7）及剪切变稀系数n（图3f）显示，CS73具有最高粘度与最强剪切变稀特性。剪切应力扫描分析（图S8）显示，CS10、CS73、CS55的屈服应力（τy）差异不显著，但其流动点（τf）分别为约12、113、122 Pa，CS37无明显流动点（图3g,h），表明其结构过于固态化。粘度恢复测试（150%、200%、300%应变）显示各组恢复率均超过90%，差异不显著，具良好形变恢复能力（图3i,j）。综上，CS10挤出性佳，但因粘度与结构恢复能力不足，成型稳定性差；CS73兼具高粘度、强剪切变稀性与适中流动点，可在挤出过程中保证顺畅性与结构完整性，为打印性能最优组合。该体系的力学性能与成型稳定性优于纯胶原墨水（CS10），为后续3D负载细胞结构构建给予基础，并具潜力促进细胞机械信号传导，有利于组织再生。后续研究围绕CS73展开打印构建物的力学与细胞功能评估。

图3 搅打、挤出性测试、支柱塌陷和流变学分析过程中胶原蛋白泡沫行为的可视化。a) 搅打前后胶原基材料滴的光学图像，以 0 和 90° 倾斜 10 分钟。b) 搅打过程中分子间网络形成的示意图。c) 无喷嘴和有 18G 和 25G 喷嘴的挤出性测试（n = 10）和 d) 使用含胶原蛋白泡沫的 25G 喷嘴的支柱塌陷测试。e 和 f) 剪切速率扫描（n = 3）、g 和 h) 剪切应力扫描（n = 3）以及 i 和 j) 时间扫描（n = 3）的定量流变学分析分别用于评估泡沫的剪切稀化、流动起始和粘度恢复行为。所有数据均以平均值±SD表示（NS = 统计无显著性，* p < 0.05，** p < 0.01，和*** p < 0.001，使用带有ANOVA和Tukey的HSD事后检验的SPSS软件进行分析）

（4）搅打胶原蛋白 (CS10) 和复合生物墨水 (CS73) 的体外细胞活性

图4a展示了采用CS10和CS73生物墨水（含hASCs，1×10⁶ cells/mL）构建的3D多孔细胞结构，经1 mM龙胆紫交联1小时处理。图S9显示交联显著增强了含S–F样品的流变性能和压缩力学性能。图4b为交联后构建物的光学图像。蛋白吸附实验表明CS10和CS73对蛋白具有较强吸附能力（图S10），12小时内细胞活性明显提升，且两者差异不显著。

图4c为构建物的应力–应变曲线，结果显示CS73因IPN结构的形成，其杨氏模量显著高于CS10，力学性能增强。图4d顺利获得活/死染色显示两组细胞存活率接近，表明生物相容性良好。图4e免疫荧光染色（DAPI、PIEZO-1、vinculin）显示，CS73在细胞黏附与力学感应相关蛋白表达上高于CS10，提示其对细胞机械信号传导具有正向调控作用（图4f），并进一步促进细胞外基质形成与成熟（图4g）。RT-PCR结果显示，CS73中大多数与机械转导相关的基因表达水平高于CS10（图4h），表明其增强的力学性能可激活相关细胞信号通路，促进组织再生相关生物学过程。

图4 3D 细胞负载复合泡沫的制造和交联、机械测试、细胞活力和机械转导相关基因表达分析。a) 使用京尼平制造 3D 细胞负载复合泡沫结构和交联过程的示意图。b) CS10 和 CS73 3D 构造 (n = 3) 的光学图像和 c) 拉伸机械结果（应力-应变曲线和杨氏模量）。d) 活/死测定图像和 e) DAPI/PIEZO-1/纽结蛋白的免疫荧光图像。f) 第 1 天的初始细胞活力定量分析，以及第 1 天和第 3 天的 PIEZO-1+ 和纽结蛋白+ 区域的定量分析（n = 3）。g) 机械转导相关下游信号通路的示意图。h) 第 3 天的相对机械转导相关基因表达（n = 4）。所有数据均以平均值±SD表示（NS = 统计无显著性，* p < 0.05，** p < 0.01，和*** p < 0.001，使用 SPSS 软件顺利获得学生t检验进行分析）

（5）各向异性孔结构复合细胞结构的制备

图1d展示了顺利获得喷嘴挤出至旋转收集器实现CS73多孔生物墨水各向异性结构构建的方法。图5a、b显示在不同气压（30–45 kPa）与收集器转速（25–38 mm/s）下的挤出效果。在气压34 kPa、转速31 mm/s条件下可取得均匀、陆续在且取向良好的各向异性结构（图5c）。孔隙几何结构分析表明，经拉伸后的结构各向异性增加约两倍，孔隙率无明显变化（图S11、S12）。

图5d–f为三组细胞构建体的SEM图像：对照组Con为传统生物打印构建物（CS10不可打印），Exp1为常规打印CS73构建物，Exp2为拉伸构建物。Exp2展示出显著的纤维排列方向性，Exp1与Con则为各向同性结构。图5g和图S14显示，Exp1与Exp2中胶原纤维形成速率均高于Con，其中Exp2中的胶原纤维沿拉伸方向高度排列。

图5h与图S15显示拉伸力学性能，Exp2杨氏模量（15.4 ± 0.9 kPa）高于Exp1（12.7 ± 1.7 kPa），增强效果归因于拉伸胶原纤维的增强作用。Con构建物模量最高（20.4 ± 0.8 kPa），因其胶原含量更高（5 wt.%）且无孔结构。10–15 kPa的基底硬度已被证实可顺利获得整合素和RhoA/ROCK通路促进hASC向肌细胞分化。图S16显示Exp2在胶原酶（50 U/mL）处理1–24 h过程中，6 h起孔壁出现明显降解，但整体各向异性结构在24 h内保持稳定。

综上，拉伸过程显著影响CS73构建物中胶原纤维的排列、孔隙结构的各向异性及整体力学性能。图5i示意其顺利获得力学刺激、胶原纤维取向及结构各向异性协同作用，激活机械转导相关信号通路，提升hASC的成肌分化潜力，适用于肌肉组织再生。

图5 泡沫拉伸工艺的优化、细胞结构形态结构的比较以及拉伸泡沫中的肌肉生成诱导。针对 a) 气压（n = 20）和 b) 旋转速度（n = 20）的支柱直径分析，用于优化拉伸工艺。c) 拉伸和未拉伸泡沫支柱的光学图像。d) 传统胶原蛋白生物结构 (Con)、e) 未拉伸的泡沫生物结构 (Exp1) 和 f) 拉伸泡沫生物结构 (Exp2) 的胶原蛋白制造示意图、光学/SEM 图像和 3D 共聚焦显微镜图像。g) 胶原蛋白原纤维的取向因子 (n = 3) 和 h) Con、Exp1 和 Exp2 的拉伸应力-应变曲线。i) Exp2 中诱导肌肉生成的示意图。所有数据均以平均值±SD表示（NS = 统计无显著性，* p < 0.05，** p < 0.01，和*** p < 0.001，使用带有ANOVA和Tukey的HSD事后检验的SPSS软件进行分析）

（6）体外分析

图6a,b显示三组构建物细胞活率均＞90%。图6c,d表明，PIEZO-1与vinculin表达：Con＜Exp1＜Exp2，提示Exp2机械感应增强。图6e中，Exp2组SACs、FAK-PI3K-AKT、RhoA/ROCK、Wnt/β-catenin、MAPK和YAP/TAZ通路相关基因显著上调。图6f显示Exp2中F-actin形成与排列最明显。图6g显示Exp2组MHC表达和对齐程度高于Con与Exp1，图6h定量分析证实Exp2具有更高的MHC阳性面积、融合指数和成熟指数，图6i进一步验证MHC和α-actinin蛋白表达最高。图6j表明Exp2组Pax7在第14天上调，Myog、Myod1和Myh2在后期持续升高，肌源分化与成熟水平最强。结果表明，Exp2顺利获得结构对齐与机械刺激促进hASC成肌分化和肌肉再生。

图6 评估生物结构中的机械转导和肌肉生成。 a) Con、Exp1 和 Exp2 生物结构的活/死实验、DAPI、PIEZO-1、纽结蛋白和鬼笔环肽的荧光图像。b) 第 1 天的初始细胞活力（n = 4）。分别在第 1 天和第 3 天对 c) PIEZO-1+（n = 4）和 d) 纽结蛋白+（n = 4）区域进行定量分析。e) 第 3 天（n = 4）的相对机械转导相关基因表达。f) 对第 7 天（n = 4）鬼笔环肽+区域（n = 4）进行定量分析并计算取向因子。 g) 第 28 天的 DAPI/MHC 免疫荧光图像。h) 定向因子（n = 3）、MHC+ 区域（n = 4）和融合/成熟指数（n = 4）的定量分析。i) 第 28 天从载细胞构建体中提取的 β-肌动蛋白、MHC 和 α-辅肌动蛋白的蛋白质印迹。j) 第 14 天和第 28 天的相对肌生成相关基因表达以及第 28 天琼脂糖凝胶电泳上的 RT-PCR 产物（n = 4）。所有数据均表示为平均值±SD（NS = 统计无显著性，* p < 0.05，** p < 0.01，和 *** p < 0.001，使用 SPSS 软件顺利获得方差分析和 Tukey 的 HSD 事后检验进行分析）

（7）体内骨骼肌再生的评估

图7a,b显示Con、Exp1与Exp2构建物成功植入VML缺损模型，4周后与sham和空白缺损组对比评估修复效果。图7c显示各实验组肌肉重量接近sham。图7d,e中，Exp2在握力与悬挂测试中表现优于其他组。图7f为HE与Masson染色结果，Exp1与Exp2组肌纤维直径接近sham，Con与缺损组显著偏小（图7g）。图7h显示，Exp2组纤维化面积与sham相当，Con与Exp1组纤维化明显增加，提示Exp2组织整合效果最佳。

图7 肌肉再生示意图和植入后分析。a）植入过程示意图。b）植入后第 0 天和第 4 周的光学图像。c）TA 肌肉重量（n = 5），d）握力（n = 5），和 e）悬挂测试（n = 5）。f）苏木精和伊红 (H&E) 和 Masson 三色（MT 染色图像和测量 g）肌纤维直径 (n = 20) 和 (h) 纤维化区域 (n = 5)。所有数据均表示为平均值±SD（NS = 统计无显著性，* p < 0.05，** p < 0.01，和 *** p < 0.001，使用 SPSS 软件顺利获得方差分析和 Tukey 的 HSD 事后检验进行分析）

图8a–d免疫染色结果显示，Exp2组肌肉再生水平与sham接近，优于Con与Exp1。ASCs成肌分化呈Con＜Exp1＜Exp2递增趋势。CD31标记的血管分析表明，Exp2组血管面积显著小于其他组，提示血管已进入成熟重塑阶段。图8e GSEA分析显示，Exp2在骨骼肌再生与氧化磷酸化（OXPHOS）相关基因集中的富集程度（NES）高于Con与Exp1，与sham接近。图8f富集曲线显示：肌肉再生相关基因在sham与Exp2中趋向下调，在Con与Exp1中上调；OXPHOS相关基因则相反，sham与Exp2中上调，Con与Exp1中下调。综上，Exp2构建物在促进肌肉再生、血管成熟及功能恢复方面表现最佳（图7d,e），其基因表达谱与生理状态更接近，修复效果优于Con与Exp1。

图8 肌肉再生的免疫组织化学分析，以及关键基因集的基因集富集分析 (GSEA)。a) DAPI/MHC/MRPL11/CD31 的免疫化学染色图像和 b) MHC 阳性区域 (n = 3)、c) MRPL11 阳性细胞相对于 MHC 阳性细胞 (n = 3) 和 d) 血管面积 (n = 3) 的量化结果。GSEA 包括 (e) 显示富集基因集的气泡图和 f) GSEA 中确定的关键基因集的富集图，显示排序基因列表中的运行富集得分。所有数据均表示为平均值±SD（NS = 统计无显著性，* p < 0.05，** p < 0.01，和 *** p < 0.001，使用 SPSS 软件进行方差分析和 Tukey 的 HSD 事后检验）

图9a–c免疫染色显示，缺损组和Con组中M1（MHC II⁺）和M2（CD206⁺）巨噬细胞水平较高，Exp1与Exp2组炎症反应较弱，接近sham。结果表明，胶原-SF复合泡沫具有良好体内生物相容性，适用于安全植入。

图9 免疫应答分析。a) b) MHC II（M1 巨噬细胞）（n = 3）和 c) CD206（M2 巨噬细胞）（n = 3）的免疫化学染色及阳性区域定量结果。比例尺 20 µm。所有数据均以平均值 ± SD 表示（NS = 统计学无显著性，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，使用 SPSS 软件进行方差分析和 Tukey's HSD 事后检验）